本試劑為4％多聚甲醛，由0.1M PB溶解。未經(jīng)DEPC處理。

本試劑為-20度保存，如果經(jīng)常使用，可放2-8度。解凍后，混勻使用。

關于固定方法與時間，以及適合標本，請自行參考文獻。

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不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響

【摘要】  目的：觀察應用與不應用多聚甲醛心臟灌注這兩種不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響。方法：20只新生大鼠隨機化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。灌注組經(jīng)麻醉后經(jīng)左心室插入灌流針，先灌注冰凍無菌生理鹽水再灌注4％多聚甲醛，灌注同時切開小部分肝臟，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)麻醉后直接斷頭取腦，其它固定方法同灌注組。進行石蠟切片HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果：灌注組腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，無共染現(xiàn)象, 組織切片完整均勻，皮層及海馬區(qū)組織、細胞形態(tài)正常，未見擴張的毛細血管。非灌注組大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細胞邊界模糊不清，核著色不良，部分視野可見擴張的毛細血管，血管內(nèi)有血細胞樣物。結(jié)論：應用多聚甲醛心臟灌注對新生大鼠腦組織的固定效果較好，是應用動物腦組織切片進行形態(tài)學研究實驗的*的步驟。

【關鍵詞】  新生大鼠 大腦 組織固定 組織切片

    新生大鼠腦組織切片是觀察新生大鼠腦組織病理損傷的主要實驗方法之一。在進行腦組織切片之前，需對處死的新生大鼠鼠腦進行固定。有文獻表述直接把處死的鼠腦浸泡在4％多聚甲醛溶液中固定，也有文獻介紹應用在體心臟灌流術經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛后再浸泡固定方法［1］。為對比這兩種方法對新生大鼠腦組織切片的影響，我們在進行新生大鼠實驗中分別應用這兩種方法，觀察直接固定與在體心臟灌流術后固定對新生大鼠腦組織切片的影響。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料 

　　多聚甲醛由廣州化學試劑廠生產(chǎn)，4%多聚甲醛臨用前配制，配制后過濾去除小的雜質(zhì)，配制后放置到冰箱中，冷卻到4 ℃后使用。Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)及Olympus CHC-212生物顯微鏡為日本公司生產(chǎn)。

　　1.2  動物分組 

　　7日齡新生SD大鼠性別不限，體重10～15 g，共20只，由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗動物編號，采用隨機數(shù)字表進行隨機化分為灌注組與非灌注組，每組各10只。

　　1.3  新生大鼠大腦組織固定與樣本準備 

　　灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后固定于自制的手術木板上，置于解剖盤中，開胸暴露并游離出心臟，切開右心房，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，灌注同時切開小部分肝臟，先灌注冰凍無菌生理鹽水（4 ℃）30～50 mL直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，后再灌注冰凍（4 ℃）4％多聚甲醛30～50 mL，斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時，再經(jīng)70％、80％、95％、100％乙醇及二甲苯浸泡，石蠟包埋。非灌注組新生大鼠經(jīng)乙mi吸入麻醉后直接斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24小時，其它固定方法同灌注組。

　　1.4  樣本切片與HE染色 

　　切片自視交叉冠狀平面開始，切至出現(xiàn)海馬結(jié)構(gòu)，片厚5 μm，每隔5張取1張，每個標本取10張，黏于多聚賴氨酸處理后的切片上，進行HE染色觀察鼠腦組織結(jié)構(gòu)。每張腦切片取左側(cè)顳頂葉皮層及左側(cè)海馬CA1區(qū)中段隨機各取6個視野拍照。

　　2  結(jié)果

    灌注組應用4%多聚甲醛灌注過程中觀察到新生大鼠四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身強直現(xiàn)象。灌注組新生大鼠大腦組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞核染色鮮艷，核無明顯腫脹，核漿對比度好，無共染現(xiàn)象, 組織切片更加完整均勻，鏡下與石蠟切片相似，皮層及海馬區(qū)組織、細胞形態(tài)正常。未見擴張的毛細血管。見圖1、圖2。非灌注組新生大鼠大腦皮層及海馬區(qū)組織水腫，細胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細胞邊界模糊不清，細胞核著色不均，部分視野可見擴張的毛細血管，血管內(nèi)有血細胞樣物。見圖3、圖4。
  
　　3  討論

    病理標本的制作和組織切片都必須先進行固定。如果固定不佳，制片的其它程序?qū)踪M時間，沒有很好的固定，HE染色就難以進行。新生大鼠腦組織切片常用于對新生大鼠腦形態(tài)學影響的研究，比如免疫組化、細胞凋亡等實驗。組織的固定是形態(tài)學研究中*的重要步驟。組織的固定有以下作用：抑制細胞內(nèi)溶酶體酶的釋放和活性，防止自溶；抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐壞，使細胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖等各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，以防止物質(zhì)擴散并維持原有的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)； 固定后的組織對染料有不同的親和力，染色后可產(chǎn)生不同的折射率，顏色更為清晰鮮明，便于觀察，硬化組織，便于切片［2］。還可將抗原固定在原位，保持其抗原性，使抗原能準確可靠地顯示出來［3］。在進行動物腦實驗應用的固定劑中，zui常用的是多聚甲醛［4，5］。有研究認為應用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定效果［6］。

    我們實驗結(jié)果表明，應用4％多聚甲醛心臟灌注及腦標本浸泡對新生大鼠腦組織的固定效果較好，組織切片組織結(jié)構(gòu)清晰完整，染色滿意。而不用4％多聚甲醛心臟灌注僅腦標本浸泡固定的效果就相對較差，組織水腫，細胞周圍間隙增寬，胞體腫脹，有些細胞邊界模糊不清，染色欠滿意。說明應用4％多聚甲醛心臟灌注這一步驟*。我們分析認為應用4％多聚甲醛心臟灌注可能有如下作用：①標本血管沖洗，減少血管內(nèi)血液有形成分存留，影響切片形態(tài)學觀察。②多聚甲醛經(jīng)毛細血管快速滲入組織中起固定作用。而不進行心臟灌注僅僅標本浸泡，多聚甲醛可能要經(jīng)較長時間才能滲入組織中起固定作用。尤其固定較大的標本時固定劑需更長時間才能滲入組織中。我們應用的新生大鼠腦標本遠較大鼠小。③減少組織細胞自溶現(xiàn)象。我們實驗未觀察到明顯的細胞自溶現(xiàn)象。但部分細胞腫脹，可能由于腦標本尚小的原因，不排除對于較大標本會進一步發(fā)生細胞自溶現(xiàn)象。

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